北京時間2022年4月6日，《自然》雜志在線刊登了肖百龍與李雪明團(tuán)隊合作完成的題為“PIEZO1在脂膜中的結(jié)構(gòu)形變與曲率感知”的論文。
該研究首次解析了機(jī)械力受體PIEZO1在脂膜環(huán)境中的受力形變過程，定量了其皮牛尺度的機(jī)械敏感性，建立了其曲率感知理論學(xué)說，從根本上解答了其將物理機(jī)械刺激轉(zhuǎn)化成生物電信號這一核心科學(xué)問題。
PIEZO諾獎研究的未解之謎：如何感受機(jī)械力？
機(jī)械力感知決定我們的日常行為，例如握手、擁抱、親吻、行走、刷手機(jī)、血壓飆升等。力是無形的，那我們?nèi)梭w如何感知？直到2010年，Ardem Patapoutian教授團(tuán)隊報道了一類介導(dǎo)人體機(jī)械力感知的分子受體—PIEZO蛋白，為我們認(rèn)識了解這一基本的生物學(xué)問題帶來了突破。因為發(fā)現(xiàn)PIEZO并證明其觸覺受體的功能，Ardem Patapition與David Julius教授(溫度受體發(fā)現(xiàn)者)分享了2021年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎（圖1）。
圖1?2021諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)委員會發(fā)布的示意圖總結(jié)了PIEZO的發(fā)現(xiàn)（上半部分）、所介導(dǎo)的觸覺、本體覺感知等生理病理功能（下半部分右側(cè)）、以及結(jié)構(gòu)模型與機(jī)械力感知假說猜想（下半部分左側(cè)）
那么PIEZO蛋白又是如何將物理機(jī)械刺激轉(zhuǎn)化成生物電信號的呢？肖百龍及其團(tuán)隊近10年致力于解答這一核心科學(xué)問題。其于2012年在Patapoutian課題組從事博士后研究期間首次證實了PIEZO蛋白是在哺乳動物中鑒定發(fā)現(xiàn)的首類機(jī)械門控陽離子通道（Nature 2012）；隨后其課題組與合作者在PIEZO的結(jié)構(gòu)功能機(jī)制研究方面取得了一系列重要研究進(jìn)展，幫助推動了PIEZO的發(fā)現(xiàn)與研究成為了2021年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎研究成果（圖2）。
圖2?PIEZO的機(jī)械力感知分子機(jī)制研究進(jìn)展總結(jié)基于肖百龍與李雪明課題組合作解析的PIEZO家族成員PIEZO1(1)與PIEZO2(2)的三維結(jié)構(gòu)[MacKinnon(3)以及Patapoutian & Ward(4)課題組也同時報導(dǎo)了PIEZO1的結(jié)構(gòu)]以及機(jī)制研究(5, 6)，研究者們提出了PIEZO的機(jī)械力感知機(jī)制猜想：PIEZO形成三聚體三葉螺旋槳狀離子通道，中心是負(fù)責(zé)離子通透的孔道部分，外周是三個負(fù)責(zé)機(jī)械力感知的槳葉部分（圖1及圖3左側(cè)）。非常有趣的是，在孔道處于關(guān)閉態(tài)，嵌在細(xì)胞膜中的槳葉呈現(xiàn)往細(xì)胞外高度彎曲的狀態(tài)，提示其可以彎曲其所在的細(xì)胞膜，形成我們稱之為納米碗（nanobowl）狀的PIEZO-脂膜體系（圖1及圖3右側(cè)）。有研究顯示PIEZO1蛋白可以在受力刺激下發(fā)生可逆的形變(7)。基于這些結(jié)構(gòu)功能研究，研究者們提出當(dāng)細(xì)胞膜張力改變時，PIEZO可以從彎曲狀變?yōu)槠秸範(fàn)睿瑤又虚g的孔道開放，從而將機(jī)械力刺激轉(zhuǎn)化為陽離子流通。
圖3?PIEZO通道的三聚體三葉螺旋槳狀（左側(cè)部分，俯視圖）與納米碗狀（右側(cè)部分，平視圖）三維結(jié)構(gòu)但事實上，在2021年諾獎頒布時，研究者們還未能解析出PIEZO受力開放的結(jié)構(gòu)。膜上PIEZO在受力后是否會如諾獎示意圖中所展示的一樣（圖1），從彎曲的關(guān)閉態(tài)進(jìn)入平展的開放態(tài)？這是PIEZO諾獎研究的未解之謎。
挑戰(zhàn)與突破：如何引入力？
得益于冷凍電鏡在生物大分子結(jié)構(gòu)解析方面的技術(shù)突破，研究者們可以解析出蛋白在靜息、游離狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)。但是，生物大分子并不是靠“呆若木雞”的狀態(tài)來發(fā)揮功能，其千姿百態(tài)的變化才是生命奧妙所在，而這些變化往往取決于其組裝形式、配體結(jié)合和所處的物理狀態(tài)（膜環(huán)境、電勢能、溫度和力等）。如何在嚴(yán)苛的冷凍樣品狀態(tài)下，引入無形的膜張力來獲取PIEZO的不同結(jié)構(gòu)功能狀態(tài)呢？
肖百龍與李雪明指導(dǎo)四位博士生楊旭中、林超、陳旭東、李首卿對這一極具挑戰(zhàn)的科學(xué)問題開展研究，借鑒前人把膜蛋白重組進(jìn)脂質(zhì)體中，并用冷凍電鏡解析其結(jié)構(gòu)的技術(shù)(8, 9)，經(jīng)過反復(fù)嘗試、摸索，最終首次建立了膜上受力結(jié)構(gòu)解析體系(圖4)。該策略的核心是通過蛋白與脂質(zhì)體之間的曲率差異（curvature mismatch）來引入膜張力，這對PIEZO蛋白尤為適用，因為PIEZO的114個跨膜結(jié)構(gòu)域形成的跨膜區(qū)并不在一個平面上，而是形成納米碗狀的凹陷結(jié)構(gòu)(圖3)。
圖4?PIEZO1-脂質(zhì)體冷凍電鏡三維結(jié)構(gòu)解析PIEZO1的形變與曲率感知特性
PIEZO1本身的曲率半徑接近10 nm，其主要以outside-in的方式重組到脂質(zhì)體中。在同等大小的脂質(zhì)體中時，曲率相符呈圓形。當(dāng)它重組進(jìn)更大的脂質(zhì)體中時，曲率半徑的差異在兩者間產(chǎn)生力，蛋白和膜發(fā)生形變，呈水滴狀（圖4c）。
而當(dāng)一小部分PIEZO1以outside-out的方式重組到脂質(zhì)體中（圖4b箭頭所示），PIEZO1蛋白與脂質(zhì)體的曲率半徑朝向截然相反，膜與蛋白間產(chǎn)生的的作用力變大，導(dǎo)致PIEZO1蛋白處于受力展平的構(gòu)象狀態(tài)（圖4d）。
研究者們最終得到PIEZO1在膜上契合狀態(tài)（10 nm曲率半徑）和受力展平的兩種結(jié)構(gòu)，分別命名為彎曲（Curved）和平展（Flattened）構(gòu)象，佐證了PIEZO1蛋白具備可逆形變和感知脂膜曲率變化的特殊能力（圖5）。
圖5?PIEZO1的彎曲（左側(cè)）和平展?fàn)睿ㄓ覀?cè)）三維結(jié)構(gòu)視頻：Piezo在膜上契合結(jié)構(gòu)
視頻：Piezo在膜上受力展平結(jié)構(gòu)
PIEZO1的機(jī)械力感知分子機(jī)制
通過比較PIEZO1在脂膜上彎曲和平展的兩種結(jié)構(gòu)，研究者們對PIEZO1感受膜張力后的動態(tài)構(gòu)象變化、形變參數(shù)進(jìn)行了定量分析，不僅驗證了之前所提出的作用機(jī)制假說，并定量了PIEZO1的皮牛尺度的機(jī)械敏感性，進(jìn)而建立了其曲率感知理論學(xué)說(圖6)。
圖6?PIEZO1-liposome從彎曲狀到平展?fàn)畹男巫儏?shù)測量以及機(jī)械敏感性計算1. PIEZO1的受力形變：Piezo1在受力展平過程中，其末端有10 nm的向下位移、所占膜面積擴(kuò)張了300 nm2（圖6a, b）。
2. 力的感知機(jī)制—曲率形變特性：Scheuring與Mackinnon團(tuán)隊合作通過原子力顯微鏡測得PIEZO1下壓距離和所需力之間存在線性彈性關(guān)系y=7x+22(7)。引用該公式與自由能變化公式（圖6c），10 nm的位移可得出PIEZO1彎曲和平展?fàn)顟B(tài)之間存在570 pN.nm的能量壘。而Nanobowl儲存了高達(dá)300 nm2的膜面積，意味著只需1.9 pN/nm的張力就能實現(xiàn)570 pN.nm做功，這與電生理測量值1.4 pN/nm接近(10)。
3. 力的傳導(dǎo)機(jī)制—納米杠桿原理：力從外周傳遞到中央孔道區(qū)。在展平過程中，胞內(nèi)Beam長桿在接近中心孔道模塊區(qū)形成kink，符合之前提出的該位點承擔(dān)支點的功能推測（圖7）?；谑×Ω軛U原理，Beam不僅具有力的傳遞與放大功能，且具有形變緩沖作用，使長臂末端3 nm的形變縮小到短臂端1 nm的形變，使其既能控制中央孔道區(qū)的門控，又不導(dǎo)致其過度的擴(kuò)張，從而維持PIEZO通道的陽離子選擇性通透能力。
圖7?PIEZO1的納米杠桿傳遞機(jī)制4. 力的門控機(jī)制—帽子運(yùn)動，跨膜疏水門打開：PIEZO1受力展平時，使得胞外帽子與槳葉之間的相互作用被打破，帽子發(fā)生順時針旋轉(zhuǎn)，下方的跨膜孔道區(qū)發(fā)生擴(kuò)張。與PIEZO2（灰色）緊閉的跨膜區(qū)疏水門相比，PIEZO1展平狀態(tài)的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)10埃的擴(kuò)張（圖8）。?
圖8?PIEZO1的帽子-跨膜疏水門孔機(jī)制綜上，研究者們總結(jié)出PIEZO通道的受力形變與門控機(jī)制（圖9）。
1. 在靜息狀態(tài)時，PIEZO1使脂膜發(fā)生彎曲，形成碗表面積為628nm2、投影面積為314nm2的納米碗系統(tǒng)，PIEZO1與脂膜處于平衡。
2. 膜張力改變時，平衡被打破，膜帶動著PIEZO1蛋白一起展平。
3. 展平的槳葉帶動胞內(nèi)側(cè)的Beam發(fā)生杠桿運(yùn)動，把形變傳遞到孔道區(qū)胞內(nèi)側(cè)，可能通過門閂-拴鎖機(jī)制，打開三個側(cè)向出口閘門（Lateral plug gate），讓離子流入細(xì)胞 。
4. 展平的槳葉使其與帽子之間的相互作用被打破，帽子的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動，加上槳葉的展平運(yùn)動，共同使得孔道區(qū)上半段的疏水閥門打開，離子則由帽子下的空隙，側(cè)向進(jìn)入孔道。
圖9?PIEZO1的受力形變與門控機(jī)制模式圖視頻：Piezo彎曲和受力展平的結(jié)構(gòu)比較
總結(jié)而言，本研究首次實現(xiàn)了對機(jī)械力受體PIEZO1通道在脂膜上受力狀態(tài)下的動態(tài)結(jié)構(gòu)解析，揭示了其受力形變與脂膜曲率感知的特性，定量了其皮牛尺度的機(jī)械敏感性，建立了其曲率感知理論學(xué)說，從根本上解答了其將物理機(jī)械刺激轉(zhuǎn)化成生物電信號這一PIEZO諾獎研究的未解之謎。無形的力在物理上可被定義為受力對象的形變。而PIEZO正是利用其納米尺度的曲率形變?nèi)ヌ綔y皮牛尺度的力，從而成為一類低能耗的超敏機(jī)械力感受器，不由讓研究者們驚嘆生命過程與物理原理的交匯之美！
肖百龍教授、李雪明研究員為本論文的共同通訊作者，博士研究生楊旭中、林超、陳旭東、李首卿為共同第一作者。
該研究得到了國家科技部“2030科技創(chuàng)新-腦計劃與類腦計劃”重大研究項目、國家自然科學(xué)基金委杰青項目以及重點項目、清華－北大生命科學(xué)聯(lián)合中心、膜生物學(xué)國家重點實驗室、高精尖結(jié)構(gòu)生物學(xué)中心、生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心的項目經(jīng)費(fèi)支持。
感謝清華大學(xué)冷凍電鏡平臺和蛋白質(zhì)制備與鑒定平臺；王宏偉教授團(tuán)隊劉楠、徐潔提供石墨烯載網(wǎng)；閆創(chuàng)業(yè)研究員團(tuán)隊分享deep-2D腳本；張馨予、趙天放開發(fā)EPicker軟件；以及王莉、周珩、姚霞、范瀟、雷建林、李曉敏博士給予技術(shù)上的幫助。
肖百龍博士，清華大學(xué)藥學(xué)院長聘教授，博士生導(dǎo)師。近年來致力于探究哺乳動物包括人類自身如何感知機(jī)械力這一生命科學(xué)本質(zhì)問題，合作確立了PIEZO是哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的首類機(jī)械門控陽離子通道，進(jìn)而聚焦解答PIEZO通道如何將機(jī)械力刺激轉(zhuǎn)化為電化學(xué)信號這一關(guān)鍵科學(xué)問題，并致力于開發(fā)相關(guān)的新型藥物和生物技術(shù)，迄今取得了系列重要研究成果。
肖百龍實驗室長期招聘對機(jī)械力感知的分子與神經(jīng)機(jī)制研究以及藥物發(fā)現(xiàn)感興趣的博士后與科研人員，有意向者請郵件聯(lián)系：xbailong@mail.tsinghua.edu.cn。
李雪明博士，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院長聘副教授。2009年在中科院物理研究所凝聚態(tài)物理專業(yè)取得博士學(xué)位后，赴美國加州大學(xué)舊金山分校從事冷凍電子顯微學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的博士后研究。李雪明長期從事冷凍電子顯微學(xué)方法和技術(shù)的研究，以及相關(guān)的生物學(xué)應(yīng)用研究。
相關(guān)論文信息：
https://www.nature.com/articles/s41586-022-04574-8
參考文獻(xiàn)
1.Zhao QC, Zhou H, Chi SP, Wang YF, Wang JH, Geng J, et al. Structure and mechanogating mechanism of the Piezol channel. Nature. 2018;554(7693):487-+.
2.Wang L, Zhou H, Zhang MM, Liu WH, Deng T, Zhao QC, et al. Structure and mechanogating of the mammalian tactile channel PIEZO2. Nature. 2019;573(7773):225-+.
3.Guo YSR, MacKinnon R. Structure-based membrane dome mechanism for Piezo mechanosensitivity. Elife. 2017;6.
4.Saotome K, Murthy SE, Kefauver JM, Whitwam T, Patapoutian A, Ward AB. Structure of the mechanically activated ion channel Piezol. Nature. 2018;554(7693):481-+.
5.Zhao QC, Wu K, Geng J, Chi SP, Wang YF, Zhi P, et al. Ion Permeation and Mechanotransduction Mechanisms of Mechanosensitive Piezo Channels. Neuron. 2016;89(6):1248-63.
6.Geng J, Liu WH, Zhou H, Zhang TX, Wang L, Zhang MM, et al. A Plug-and-Latch Mechanism for Gating the Mechanosensitive Piezo Channel. Neuron. 2020;106(3):438-+.
7.Lin YC, Guo YR, Miyagi A, Levring J, MacKinnon R, Scheuring S. Force-induced conformational changes in PIEZO1. Nature. 2019;573(7773):230-+.
8.Wang L, Sigworth FJ. Structure of the BK potassium channel in a lipid membrane from electron cryomicroscopy. Nature. 2009;461(7261):292-5.
9.Yao X, Fan X, Yan N. Cryo-EM analysis of a membrane protein embedded in the liposome. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020;117(31):18497-503.
10.Lewis AH, Grandl J. Mechanical sensitivity of Piezo1 ion channels can be tuned by cellular membrane tension. Elife. 2015;4.
關(guān)鍵詞：
